二倍体青钱柳愈伤组织诱导及次生代谢物积累

doi:10.7525/j.issn.1673-5102.2025.04.006

摘要/Abstract

摘要：

为探索激素组合对二倍体青钱柳（Cyclocarya paliurus）愈伤组织诱导和增殖的影响，以及继代增殖过程中主要次生代谢产物的积累规律，该研究以二倍体青钱柳叶片为外植体材料，采用正交试验设计，研究不同激素组合对愈伤组织诱导和继代增殖过程中次生代谢物积累的影响，以总三萜、总多酚、总黄酮、粗多糖产量为指标，采用熵权法筛选优良继代配方。处理2（0.5 mg·L^-1 6-BA+1 mg·L^-1 2，4-D+0.2 mg·L^-1 NAA）下二倍体青钱柳愈伤组织诱导率最高，为100%，其次是处理9（2.5 mg·L^-1 6-BA+1.5 mg·L^-1 2，4-D+0.2 mg·L^-1 NAA）和处理5（1.5 mg·L^-1 6-BA+1 mg·L^-1 2，4-D+0.4 mg·L^-1 NAA），愈伤组织诱导率分别为96.67%、93.64%。影响诱导率的因素主次顺序为2，4-D>NAA>6-BA，2，4-D最佳质量浓度为1.0 mg·L^-1，NAA最佳质量浓度为0.2 mg·L^-1，6-BA无显著影响；诱导出的愈伤组织颜色有嫩绿色、黄绿色，愈伤组织形态均呈现疏松质地。采用不同激素组合配方进行继代增殖，各处理的愈伤组织生长及代谢产物积累存在差异，同一处理下不同继代增殖过程中愈伤组织生长性状变化也较大；按综合得分排序第1的配方为处理4（0.2 mg·L^-1 KT+0.5 mg·L^-1 6-BA+0.75 mg·L^-1 NAA+0.4 mg·L^-1 2，4-D），得分为0.44，其次是处理2（0.75 mg·L^-1 6-BA+0.75 mg·L^-1 NAA+0.2 mg·L^-1 2，4-D）和处理6（0.2 mg·L^-1 KT+1.0 mg·L^-1 6-BA+0.5 mg·L^-1 NAA+0.2 mg·L^-1 2，4-D），综合得分分别为0.31、0.26。处理4下愈伤组织继代培养至第8代时，主要次生代谢物产量普遍达到较高水平，总三萜产量为28.91 mg·瓶^-1，总多酚产量为6.89 mg·瓶^-1，总黄酮产量为1.77 mg·瓶^-1，粗多糖产量为57.45 mg·瓶^-1。综上，最佳的二倍体青钱柳愈伤组织诱导配方为MS+0.5 mg·L^-1 6-BA+1.0 mg·L^-1 2，4-D+0.2 mg·L^-1 NAA，继代增殖配方为MS+0.2 mg·L^-1 KT+0.5 mg·L^-1 6-BA+0.75 mg·L^-1 NAA+0.4 mg·L^-1 2，4-D。该研究可为利用青钱柳愈伤组织培养及进一步的细胞悬浮培养生产次生代谢物提供参考。

关键词: 青钱柳, 愈伤组织诱导, 植物激素, 继代增殖, 次生代谢物

Abstract:

This study aimed to explore the effects of hormone combination on callus induction and proliferation of diploid Cyclocarya paliurus and the accumulation of main secondary metabolites during subculture. The effects of different hormone combinations on accumulation of secondary metabolites during callus induction and subproliferation were investigated using diploid C. paliurus leaves as explants by orthogonal experiment design. An optimal treatment for the maximum yields of total triterpenoids， total polyphenols， total flavonoid and crude polysaccharides were selected by entropy weight method. The highest callus induction rate was 100% in treatment 2（0.5 mg·L^-1 6-BA+1 mg·L^-1 2，4-D+0.2 mg·L^-1 NAA）， followed by treatment 9 （2.5 mg·L^-1 6-BA+1.5 mg·L^-1 2，4-D+0.2 mg·L^-1 NAA） and treatment 5（1.5 mg·L^-1 6-BA+1 mg·L^-1 2，4-D+0.4 mg·L^-1 NAA）， with an induction rate of 96.67% and 93.64%， respectively. The order of factors affecting callus induction rate was 2，4-D， NAA， 6-BA. An optimal concentration of 2，4-D and NAA was 1.0 mg·L^-1 and 0.2 mg·L^-1， with no significant effect of 6-BA. The colors of induced callus were light green and yellowish green； the morphology of the callus was characterized by loose texture. There were differences in the callus growth and accumulation of secondary metabolites among treatments when different combinations of hormones were used for subculture； the growth characteristics of calli in the same treatment changed greatly during continuous subculture. The first ranked formula was treatment 4 （0.2 mg·L^-1 KT+0.5 mg·L^-1 6-BA+0.75 mg·L^-1 NAA+0.4 mg·L^-1 2，4-D） with a score of 0.44，followed by treatment 2（0.75 mg·L^-1 6-BA+0.75 mg·L^-1 NAA+0.2 mg·L^-1 2，4-D） and treatment 6（0.2 mg·L^-1 KT+1.0 mg·L^-1 6-BA+0.5 mg·L^-1 NAA+0.2 mg·L^-1 2，4-D） with a score of 0.31 and 0.26， respectively. The yield of secondary metabolites in treatment 4 generally reached a high level from the 8th generation， with total triterpenoid yield of 28.91 mg·bottle^-1， total polyphenol yield of 6.89 mg·bottle^-1， total flavonoid yield of 1.77 mg·bottle^-1，and crude polysaccharide yield of 57.45 mg·bottle^-1. In summary， the optimal formula for callus induction of diploid C. paliurus was MS+0.5 mg·L^-1 6-BA+1.0 mg·L^-1 2，4-D+0.2 mg·L^-1 NAA. The subculture proliferation formula was MS+0.2 mg·L^-1 KT+0.5 mg·L^-1 6-BA+0.75 mg·L^-1 NAA+0.4 mg·L^-1 2，4-D. This study provided a reference for production of secondary metabolites by callus culture and further cell suspension culture.

Key words: Cyclocarya paliurus, callus induction, plant hormone, subculture proliferation, secondary metabolites

中图分类号:

Q813.1

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图/表 13

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水平Level	因素Factor
水平Level	KT/ （mg·L^-1）	6-BA/ （mg·L^-1）	NAA/ （mg·L^-1）	2，4-D/ （mg·L^-1）
1	0	0.50	0.50	0
2	0.2	0.75	0.75	0.2
3	0.4	1.00	1.00	0.4

试验号 No.	因素Factor			诱导率 Induction rate/%	愈伤组织颜色 Callus color	愈伤组织质地 Callus texture
试验号 No.	6-BA/（mg·L^-1）	2，4-D/（mg·L^-1）	NAA/（mg·L^-1）	诱导率 Induction rate/%	愈伤组织颜色 Callus color	愈伤组织质地 Callus texture
1	0.5	0.5	0	59.05±0.02^d	多数嫩绿色，少数黄绿色 Mostly light-green，a few yellow-green	疏松 Loose
2	0.5	1.0	0.2	100.00±0.00^a	嫩绿、黄绿各占半数 Half light-green，half yellow-green
3	0.5	1.5	0.4	77.75±0.06^bc	多数嫩绿色，少数黄绿色 Mostly light-green，a few yellow-green
4	1.5	0.5	0.2	74.44±0.08^bc	多数嫩绿色，少数黄绿色 Mostly light-green，a few yellow-green
5	1.5	1.0	0.4	93.64±0.06^a	嫩绿色 Light-green
6	1.5	1.5	0	67.94±0.11^cd	多数黄绿色，少数嫩绿色 Mostly yellow-green，a few light-green
7	2.5	0.5	0.4	71.59±0.12^cd	多数黄绿色，少数嫩绿色 Mostly yellow-green，a few light-green
8	2.5	1.0	0	86.90±0.07^ab	多数嫩绿色，少数黄绿色 Mostly light-green，a few yellow-green
9	2.5	1.5	0.2	96.67±0.06^a	嫩绿色 Light-green
k1	78.932	68.360	71.296
k2	78.672	93.514	90.370
k3	85.053	80.784	80.991
R	6.380	25.154	19.074

指标 Index	指标信息熵 Entropy	指标差异性系数 Difference coefficient	指标熵权 Entropy weight
总三萜产量 Total triterpenoid production	0.921	0.079	0.343
总多酚产量 Total polyphenol production	0.932	0.067	0.291
总黄酮产量 Total flavonoid production	0.957	0.043	0.186
粗多糖产量 Crude polysaccharide production	0.959	0.041	0.179

处理 No.	各指标得分 The index scores				综合得分 Comprehensive score	排名 Rank
处理 No.	总三萜产量 Total triterpenoid production	总多酚产量 Total polyphenol production	总黄酮产量 Total flavonoid production	粗多糖产量 Crude polysaccharide production	综合得分 Comprehensive score	排名 Rank
4	0.085	0.088	0.132	0.129	0.435	1
2	0.060	0.049	0.093	0.111	0.312	2
6	0.047	0.077	0.071	0.066	0.260	3
5	0.054	0.053	0.053	0.067	0.227	4
9	0.041	0.054	0.045	0.071	0.212	5